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细胞凋亡检测操作步骤之ELISA法

阅读次数:1531   发布时间:2017/7/15 16:34:06

细胞凋亡检测操作步骤之ELISA法
细胞凋亡发生时,内源性核酸内切酶将分解核小体区间的双链DNA,但核小体本身由于由组蛋白紧密结合而免受切割,单克隆抗体可以与核小体形成夹心结构,可通过检测核小体判断细胞是否经历凋亡事件。
    (一) 原理
    细胞凋亡的发生,是由于钙-镁依赖性核酸酶进入核小体间切割DNA,产生180bp~200bp或其倍数的核小体片段。而核小体由于与组蛋白H2A、H2B、H3和H4形成紧密复合物而不被核酸内切酶切割。采用双抗体夹心酶免疫法,应用小鼠抗DNA和抗组蛋白的单克隆抗体,与核小体片段形成夹心结构,可特异性检测细胞溶解物中的核小体片段。
 
    (二)材料与试剂
1.采用Boehringer Mannheim公司试剂盒,生物标记的小鼠抗组蛋白单克隆抗
体。
2.过氧化物酶(-POD)标记的小鼠抗DNA单克隆抗体
3.链霉亲合素包被的微孔板
4.DNA-组蛋白复合物,作为阴性对照。
5.ABTS底物
6.溶解缓冲液
7.温育缓冲液
8.底物缓冲液
 
    (三)样品
1.培养细胞或离体细胞的裂解物细胞裂解步骤:收集细胞,离心后,用200µl溶细胞缓冲液重新悬浮,室温下作用30min。
2.培养细胞的上清液
3.血浆(血清)
 
    (四)操作方法
1.取样品离心后(1 000r/min,10min),吸取20µl上清液,加入链霉亲合素包被的培养板孔中。
2.另加入80µl免疫反应试剂含抗-DNA-POD、抗组蛋白-生物素及温育缓冲液(按1︰1︰18混合),室温下孵育2h(置摇床上,250r/min)。
3.取上清,用300µl温育缓冲液洗涤3次,小心移去洗涤液。
4.加入100µl底物缓冲液,室温下孵育使颜色变化至适合(置摇床上)。
5.尽快作比色分析(10min~20min内),用底物缓冲液作空白对照,以波长405nm,参考波长492nm进行检测。
 
    (五)结果判定
按下列公式计算细胞释放的单/低聚核小体片段的特别聚集值:
注:mU=吸收值(10-3)=双孔吸收值的平均OD值-底物OD值,若样品的吸收值超过比色测定范围,应适当稀释后再检测。

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